Na+K+- ATP酶活性测定说明书微量法
货号:TOPEK190899
规格:100管/48样产品简介:
Na
+K
+- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成ADP和无机磷。Na
+K
+-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。
自备的仪器和用品:
酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容:
提取液:液体100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入6ml蒸馏水充分混匀待用;用不完的4℃保存一周。
试剂三:液体 2ml×1 瓶,4℃保存。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。用时加入3mL蒸馏水4℃保存。
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入25ml蒸馏水,溶解后4℃保存一周。
试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入25ml蒸馏水,溶解后4℃保存一周。
试剂七:液体25ml×1瓶,室温保存。
试剂八:10mmol/L 标准磷贮备液 1mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂八 20倍稀释,即取 0.1mL试剂八加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制:按H2O:试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
样品酶液的制备:
- 细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
- 血清(浆)样品:直接检测。
操作步骤:
分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
- 酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
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对照管 |
测定管 |
试剂一(μL) |
65 |
45 |
试剂二(μL) |
60 |
60 |
试剂三(μL) |
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20 |
样本(μL) |
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100 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min
混匀,8000g,常温离心10min,取上清液
- 定磷(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂)
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空白管 |
标准管 |
对照管 |
测定管 |
0.5μmol/ml标准磷应用液(μL) |
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20 |
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上清液(μL) |
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20 |
20 |
蒸馏水(μL) |
20 |
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定磷试剂(μL) |
200 |
200 |
200 |
200 |
混匀,室温放置30min,在 660nm处,记录各管吸光值。
注意:
- 由于每一个样都必须做对照,本试剂盒100管保证测48份Na+K+-ATP酶。
- 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
- 空白管和标准管只要做一管。
计算:
1.血清(浆)Na
+K
+- ATPase活力的计算:
定义:规定每小时每毫升血清(浆)中Na
+K
+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na
+K
+-ATP酶活力(U/mL)= (C标准管×V总)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷V样÷T=7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
2.组织、细菌或细胞中Na
+K
+- ATPase活力的计算:
a.按蛋白浓度计算:定义:规定每小时每毫克组织蛋白中Na
+K
+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na
+K
+-ATP酶活力(U/mg)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(Cpr×V样)÷T =7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
b.按样本鲜重计算:定义:规定每小时每克组织中Na
+K
+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na
+K
+-ATP酶活力(U/g)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(V样÷V样总×W)÷T=7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
3.按细菌或细胞密度计算:定义:规定每小时每1万个细菌或细胞中Na
+K
+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na
+K
+-ATP酶活力(U/10
4)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(V样÷V样总×500)÷T=0.015×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V总:酶促反应总体积,0.25mL;V样:加入样本体积,0.1mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500万。