过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒-微量法 说明书
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
货 号 ：TOPEK190893
规 格 ：100T/96S
产品内容：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 125μL×1 瓶，4℃保存。
产品说明：
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的 H2O2 清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解 H2O2，使反应溶液 240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔（UV 板）、研钵、
冰和蒸馏水
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备
收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 240nm，蒸馏水调零。
2、CAT 检测工作液的配制：用时在试剂二中加入 25mL 试剂一，充分混匀，作为工作液。
3、测定前将 CAT 检测工作液在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。
4、准备96孔UV 板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于 340nm务必使用UV 板）。
5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液，立即混匀并计时，记录 240nm
下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。计算ΔA＝A1-A2。
三、CAT 活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清（浆）CAT 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mL)= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=459×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算：
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=459×ΔA÷Cpr
- 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T=459×ΔA÷W
- 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/104 cell)＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×500）÷T =0.917×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：H2O2摩尔消光系数，4.36×104L/ mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W： 样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万；109：单位换算系数， 1 mol=109nmol。
a.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）CAT 活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mL)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=764.5×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算：
- 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T =764.5×ΔA÷Cpr
- 按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T=764.5×ΔA÷W
- 按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×500）÷T=1.529×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：H2O2 摩尔消光系数，4.36×104 L / mol/ cm；d：96 孔板光径， 0.6cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W： 样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万；109：单位换算系数， 1 mol=109nmol。
注意事项：
出现负值怎么办？ 首先检查吸光值是否超过 3，如果超过3很可能是没有用UV 板，请换用 UV 板。如果未超过 3，仍然出现负值则检查反应过程是否产生气泡，气泡多说明酶活性太高，气泡影响 产生了负值，可以将样本用提取液稀释 10 倍后再检测。如果稀释样本或反应体系没有产生 气泡仍然出现较小的负值，说明该样本测不到该酶活。 |
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