产品内容: 试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。试剂二:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存。 试剂三:液体 15mL×1 瓶,4℃避光保存。标准品:粉剂 10mg×1 支,4℃避光保存。
产品说明: 谷胱甘肽是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)组成的天然三肽,是一种含巯基(—SH)的化合物,广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和 5,5’- 二硫代-双-(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid,DTNB)反应产生 2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物,在波长 412nm 处具有最大光吸收。
自备仪器和用品:
分析天平、微量匀浆器(规格 2mL)、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计,1mL 玻璃比色皿。
一、样品的处理
1、组织处理: 新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次,然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用试剂一润洗过的匀浆器中(匀浆器提前放冰上预冷);然后加入 1mL 试剂一(组织/试剂一比例保持不变即可),迅速冰上充分研磨(使用液氮研磨效果更好);8000g 4℃离心 10min;取上清液放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。 2、血液处理 血浆:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心 10 分钟,吸取上层血浆到另一支试管中,加入等体积的试剂一, 4℃,8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。 血细胞:将收集的抗凝血于 4℃,600g 离心 10 分钟,弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次(用 PBS 重悬血细胞,600g 离心 10 分钟),加入等体积试剂一,混匀后 4℃放置 10 分钟,8000g 离心 10 分钟,吸取上清放于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。 3、细胞处理 收集不少于 106 个细胞,首先用 PBS 清洗细胞 2 次(PBS 重悬细胞,600g 离心 10 分钟),加入 3 倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞,反复冻融 2-3 次(可在液氮中冻结,37℃水浴中溶解),
8000g 离心 10 分钟,收集上清于 4℃待测,若暂时不能完成测试可放于-80℃保存(可保存 10 天)。
二、操作步骤
1、分光光度计预热 30min 以上,分光光度计调节波长至 412nm,蒸馏水调零。 2、试剂二放置 37℃(哺乳动物)或 25℃(一般物种)水浴中保温 30min。 3、空白管检测:取 1mL 玻璃比色皿,依次加入 100μL 蒸馏水,700μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀,放置 2min 后测定 412nm 吸光度 A1。 4、制作标准曲线 称 1mg 标准品用 1mL 蒸馏水溶解,浓度为 1mg/mL。取适当溶液配制浓度为 200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL 的标准品(试剂一十倍稀释后进行稀释)。 取 1.5mLEP 管依次加入 100μL 标准品,700μL 试剂二,200μL 试剂三,每管混匀后静置 2min, 检测 412nm 处吸光度,吸光度减去空白孔(A1)为横坐标,根据吸光度(x)和浓度(y,μg/mL) 做出标准曲线。 5、样品管测定:取 1mL 玻璃比色皿,依次加入 100μL 样品,700μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后静置 2min 检测 412nm 处吸光度 A2,△A= A2- A1。
三、GSH 含量计算
根据标准曲线,将样品△A 带入公式中(x),计算出样品浓度 y(μg/mL)。
- 按蛋白浓度计算
GSH(μg / mg prot)=y×V 样÷V 样÷Cpr =y÷Cpr
- 按样本质量计算
GSH(μg /g)= y×V 样÷(V 样÷V 样总×W)= y ÷W
- 按细胞数量计算
GSH(μg /104 cell)= y×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)= y ÷细胞数量
- 按液体体积计算
GSH(μg / mL)= 2y V 样总:上清液总体积,1 mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mL;W:样品质量,g ;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;细胞数量:以 106 为单位计量;2:血浆(血细胞) 体积被稀释一倍。
注意事项:
1、样品处理需匀浆完全,若当天不能完成测量,可放-80℃保存。 2、标准品:还原型谷胱甘肽现配现用。 3、若不确定样品中 GSH 含量的高低,可稀释几个梯度后再进行测量。 4、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂,因此上清液不能用于蛋白浓度测定。 |