● 使用说明：
第一次收到该产品，室温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底，根据需要适量分装成小管，-20℃贮存，每次取一小管使用；本产品每次使用前，要95℃加热处理5分钟。
一. 制胶：
I 配制分离胶
1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（19:1）、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合。
2．加入10%APS和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3．在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的水层，使凝胶表面保持平整。
4．静置5-10分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。
表一 （一块0.75mm mini胶用量）
| |
分离胶 |
浓缩胶 |
| |
18％T, 5%C /6.0 ml |
5％T, 3.3%C/2 ml |
| 40% PAA（19:1） |
2.7 ml |
/ |
| 40% PAA (29:1) |
/ |
0.25 ml |
| 4×多肽电泳凝胶缓冲液 |
1.5 ml |
0.5 ml |
| 乙二醇（电泳级） |
1.8 ml |
/ |
| ddH2O |
/ |
1.25 ml |
| 10％APS |
50-65 μl |
20 μl |
| TEMED |
6 μl |
2 μl |
注：如非必须，不要使用1.0mm和1.5mm的凝胶，尽量使用厚度0.75mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。
II 配制浓缩胶
去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去。
1．按照表一将不同体积的双蒸水、40%PAA（29:1）和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合。
2．加入10%过硫酸铵和TEMED，立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。
3．将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
4．静置20-30分钟装待凝胶聚合
二. 电泳：
1. 取一管分装好的Marker样品，彻底融化，95℃加热处理5分钟，充分混匀后备用。
2. 电泳前，将10×Tris-Tricine-SDS电泳缓冲液（Cat No：CB010）用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。将电泳槽的内外槽加入1×缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或蛋白样品（样品已经过2×Tricine上样缓冲液[Cat No：TP050]处理）加入点样孔，根据表二条件进行电泳，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要2-3个小时。注：如果电泳时间过短，染色时，指示前沿容易遮挡小于5kd的小肽。
表二 多肽电泳条件
| 恒电压 |
150 V |
| 起始电流 |
45-55 mA |
| 结束电流 |
10-15 mA |
| 电泳时间 |
2-3小时 |
三. 染色
根据常规实验步骤，用配方5和6（表三）进行染色和观察。如果使用配方5进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），该产品能在5分钟之内完成蛋白的染色，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。
表三 小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制
1. 40%PAA（29:1）（配制浓缩胶）
丙稀酰胺 38.67g
甲叉双丙稀酰胺 1.33g
用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。
贮存：4℃避光保存 |
2. 40% PAA（19:1） （配制分离胶）
丙稀酰胺 38 g
甲叉双丙稀酰胺 2 g
用ddH2O溶解后定容至100 ml，过滤后使用。
贮存：4℃避光保存 |
3. 4×多肽电泳凝胶缓冲液（配制凝胶用）
[3MTris; 0.3% SDS; pH8.45]
Tris碱 182g
ddH2O 300ml
1.5 g SDS或15ml 10％ SDS
用HCl调pH值至8.45
用ddH2O定容至500ml
贮存：4℃ |
4. 10×Tris-Tricine-SDS电泳缓冲液
[1MTris;1MTricine ;1% SDS; pH 8.3]
Tris碱 121.14g
Tricine 179.2g
SDS10g
用ddH2O溶解，定容至1000ml(不用调pH)。
贮存：4℃
注：使用前稀释成1×缓冲液使用 |
5. 染色液
冰醋酸 100 ml
甲醇 450 ml
考马斯亮蓝G-250 0.25 g
水 450 ml
6. 脱色液
冰醋酸 100ml
水 900ml |
7. 2×Tricine蛋白样品上样缓冲液（10ml）
1ml 1MTris-Cl pH6.8
2.4ml 甘油
0.8g SDS
0.31g DTT（或者400μl β-巯基乙醇）
2mg 考马斯亮蓝G-250
用灭菌ddH2O定容至10ml
混匀分装-20℃贮存备用 |
|
中文
英文
