| 中文名称 |
2XSYBR Green qPCR Mix (Sybr green 荧光染料法定量PCR) |
| 产品介绍： |
产品简介： 本制品本制品是采用 SYBR® Green I 嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA 聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA 和 SYBR® Green I 等试剂预混成一种适合Real Time PCR 反应检测用 2×Premix Type 试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。本品采用全新的 Hotmaster Taq DNA聚合酶，该酶不同于一般Hot-start 酶之处在于，一般的 Hot-start 酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性，而 Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭 Hotmaster Taq DNA 聚合酶的底物结合位点，温度低于 40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此最大限度的减少PCR 扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量 PCR 反应的精确性。
储存：－20 ℃ 避光保存至少12 个月，使用前充分融解混匀。短期使用可放在 4 ℃，避免反复冻融。
注意事项：
1、本制品不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，配套ROX产品 Rox Reference Dye。
2、本制品含SYBR® Green I 强光下易分解，降低敏感度，使用时避免长时间强光照射本制品。
3、建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4、本制品含有4 mM MgCl2（反应体系终浓度是2 mM Mg2+），可用25mM MgCl2 优化Mg2+浓度。
建议PCR条件(以20，50 μl反应体系为例，反应液配制请在冰上进行)
| Components |
Volume（20 μl） |
Volume（50 μl） |
Final Concentration |
| 2 x SYBR qPCR Mix |
10μl |
25 μl |
1× |
| DNA Template |
1 μl |
2 μl |
as required |
| Forward Primer (10 μM) |
0.4 μl |
1 μl |
0.2 μM each |
| Reverse Primer (10 μM) |
0.4 μl |
1 μl |
0.2 μM each |
| ddH2O to final volume |
20 μl |
50 μl |
Not applicable |
![\"\"](\"http://www.bjbiotopped.com/d/file/rsjrl/2023-03-31/24c200384d3668608e282865037437da.png\")
说明：本制品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说，二步法扩增特异性高， 三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
荧光定量PCR 实验常见问题和解决方案
A1: 无信号值出现
Q1：
1、反应循环数不够。一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至 45cycles），但高于 45 个循环会增加过多的背景信号。
2、检测荧光信号的步骤有误。一般SG 法采用 72℃延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3、引物或探针降解。可通过PAGE 电泳检测其完整性。
4、引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5、模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6、模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
A2: CT 值出现过晚
Q2：
1、扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2、PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
3、PCR 产物太长。一般采用 100-150bp 的产物长度，一般不超过 500bp。
A3: 标准曲线的线性关系不佳
Q3：
1、加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3、引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
典型扩增曲线和融链曲线图（使用本制品在 Roche Light Cycler 480 II 三步法操作实际图片）
![\"\"](\"http://www.bjbiotopped.com/d/file/rsjrl/2023-02-17/1303db97ec8e7279e5ad1cb653a4758b.png\")
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备注:
以上数据均来自公开文献,博奥拓达暂未进行独立验证,仅供参考。
These protocols are for reference only. Biotopped does not independently validate these methods.
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